Pesquisador(es)
Pesquisador(es) Responsável(eis):
Amilcar Tanuri
Instituição
Instituição:
Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia, Departamento de Genética, Laboratório de Virologia Molecular Animal.
Parcerias institucionais:
.
Período de Vigência:
?
Situação:
Concluída
Introdução e Justificativa
Considerando a emergência e transmissão de cepas do vírus resistentes às drogas disponíveis no mercado que implicam ineficácia terapêutica, esta pesquisa buscou determinar se a falência terapêutica em pacientes em uso de “combinação potente” de anti-retrovirais está associada à resistência genotípica do HIV diante das drogas. As 339 amostras coletadas em cinco estados e no DF foram submetidas a testes rápidos de determinação de resistência genotípica dos genes da TR (LIPA) e protease (RPLP). Os resultados obtidos indicam alta correlação entre falha terapêutica e mutação, embora não se saiba exatamente se a falha terapêutica foi causada por uma falta de aderência. O trabalho validou a utilização da carga viral como um bom parâmetro clínico para se desconfiar da presença de um vírus resistente nos pacientes em tratamento.
Objetivos
Determinar se a falência terapêutica em pacientes em uso de “combinação potente” de anti-retrovirais está associada à resistência genotípica do HIV perante as drogas; Testar a performance das metodologias rápidas de determinação de resistência genotípica dos genes da TR (LIPA) e protease (RPLP) nas amostras brasileiras.
Materiais e Método
Trata-se de estudo de corte transversal utilizando-se material biológico (RNA e/ou plasma) estocado nos laboratórios da Rede Nacional de Carga Viral do MS que corresponderam aos critérios de inclusão definidos para o estudo: pacientes HIV+ maiores de 18 anos, de ambos os sexos; pacientes em uso de regime de associação de 3 anti-retrovirais pelo me-nos, incluindo um inibidor de protease, por Período superior a 3 meses e, Carga Viral para o RNA do HIV-1 superior a 30.000 cópias/ml após 3 meses de tratamento. Como método de genotipagem rápida para o gene da transcriptase reversa foi escolhido o LIPA (Line Probe Assay). Esse método está baseado na hibridização com uma série de primers, representando a seqüência selvagem e as diversas mutações de resistência, ligados a nitrocelulose como produto biotinilado de PCR representando o gene TR do paciente. A reação é revelada com a adição de streptoavidina fosfatase alcalina. O LIPA pode revelar mutações nas posições 41, 61, 74, 184, 214 e 215. Essas mutações são importantes para resistência a: AZT, DDI, DDC e 3TC. O gene da protease foi avaliado como método de restrição em que a seqüência completa da protease do HIV-1 será simplificada por PCR e o produto digerido com a enzima Hinc II. Essa enzima corta o gene na posição que co-difica os aminoácidos 82 e 90 de todas as seqüências selvagens (sem mutação para resistência) brasileiras independentemente do subtipo a que elas pertençam (B, C, D ou F). A perda dos sítios dessa enzima indica mutação nessas posições. Às posições 82 e 90 estão implicadas na resistência a Ritonavir, Indinavir e Saquinavir. Assim, esse método de res-trição é um método rápido e de baixo custo para revelar mutações relevantes para resistência nessa região genômica. Amostras analisadas, por Estado: SC – 70; ES – 32; DF – 48; SP – 50; RJ – 97 e PE – 42. (total = 339). Sendo um estudo anônimo não vinculado, foi feito um questionário visando à obtenção de dados clínicos dos pacientes de uma forma a não vinculálo aos pacientes em estudo. Os pacientes foram identificados por números e os dados laboratoriais (CV e CD4) por faixas, a fim de dificultar sua identificação posterior.
Resultados - Parciais ou Finais
A análise dos dados obtidos demonstrou alta correlação entre falha terapêutica e mutação. Não se sabe se a falha terapêutica foi causada, primariamente, por uma falta de adesão ou não. Uma vez , porém, mantida a carga viral alta por mais de três meses, a seleção de linhagens mutantes resistentes aos ARV pode ser observada.
Este trabalho validou a utilização da carga viral como um bom parâmetro clínico que remete a indício da presença de um vírus resistente nos pacientes em tratamento.
Resultados da análise genética das amostras nas regiões da transcriptase reversa (TR) e protease (Pro):
Análise genética da região.
MUT WT
40,8
TR
Pro
Freqüência (%)
WT a
WT
14,5
WT
MUT b
7,5
MUT
MUT d
37,2
a – –(WT): seqüências selvagens.
b – (MUT): seqüências apresentando mutação relacionada à resistência aos ARV.
c – Nesta análise foram utilizadas somente 255 amostras que tinham os seus dados genéticos completos, ou seja, LIPA e RFLP do gene da protease.
d – Neste caso, foi considerado mutante no gene da protease qualquer mutação analisada pelo RFLP (posição 82 e 90) ou a presença de amostras mistas.
Novas análises estatísticas estão sendo feitas tentando correlacionar as taxas de mutação com carga viral, contagem de CD4 e esquema terapêutico. Também será analisada a performance do LIPA nas amostras brasileiras, em sua especifici-dade e sensibilidade.
Palavras-Chave:
Retrovírus do HIV. Genotipagem do HIV. Resistência do HIV perante os anti-retrovirais.