Pesquisador(es)
Pesquisador(es) Responsável(eis):
Márcio José Poças Fonseca
Instituição
Instituição:
Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Genética e Morfologia.
Homepage:
Parcerias institucionais:
.
Período de Vigência:
2004 – 2005
Situação:
Concluída
Introdução e Justificativa
O envelope glicoprotéico do HIV (ENV) é um alvo interessante de novos agentes anti-retrovirais, por estar presente tanto na superfície do vírus quanto das células infectadas, e por mediar os eventos iniciais da infecção viral. Com este projeto, estabelecemos um protocolo para amplificação dos fragmentos gênicos correspondentes à gp160, gp120 e gp41, a partir de uma amostra de cDNA viral, subtipo C. Os produtos de amplificação foram clonados e seqüenciados, estando prontos para subclonagem em vetor de expressão em células de mamíferos, uma vez que o objetivo desta pesquisa é a obtenção de linhagens recombinantes de CHO K1 capazes de expressar as glicoproteínas virais em sua forma nativa, mimetizando células CD4 infectadas. Tais células serão empregadas na posterior seleção de anticorpos neutralizantes, obtidos a partir de biblioteca apresentada na superfície de fagos (phage display).
Objetivos
Estabelecer um protocolo otimizado de expressão, em células de mamíferos, da gp120 e gp41 de virotipos brasileiros do HIV-1.
Materiais e Método
Amostras de cDNA viral, retrotranscrito a partir de RNA extraído de plasma sanguíneo de pacientes infectados, foram utilizadas para a amplificação por nestedPCR das regiões gênicas correspondentes à gp160, gp 120 e gp41 do HIV-1. Os fragmentos de DNA amplificados foram utilizados para clonagem no vetor pGEMT easy (Promega), que por sua vez foi utilizado para a transformação de linhagens bacterianas de Escherichia coli. Realizou-se então a extração do DNA plasmidial dos clones bacterianos recombinantes e a confirmação da presença do inserto, por meio do perfil de restrição e por PCR. Os DNAs plasmidiais dos recombinantes foram seqüenciados no aparelho MegaBace 1000 do Laboratório de Biologia Molecular da Universidade de Brasília. As regiões gênicas estão sendo subclonadas no vetor pMAC/PS para posterior transfecção de células CHOK1.
Resultados - Parciais ou Finais
Após um a série de PCRs de padronização, foi estabelecido um eficiente protocolo para a amplificação dos fragmentos gênicos referentes à gp160 (2,6 kb), gp120 (1,5 kb) e gp41 (1,3kb) a partir da amostra de cDNA 116/00, subtipo C. Esses produtos de amplificação foram clonados em pGEMT easy e transformados por eletroporação na linhagem de E. coli XL1-Blue. A presença dos insertos nos DNAs plasmidiais dos clones recombinantes foi evidenciada pela digestão dos plamídeos com a endonuclease de restrição EcoR I e por PCR, utilizando-se os oligonucleotídeos específicos para cada fragmento gênico. O seqüenciamento dos clones recombinantes foi feito pela estratégia de primer walking, não sendo evidenciados códons de terminação que pudessem eventualmente levar a formas truncadas das glicoproteínas de interesse. Também não foram verificadas mutações de seqüência, tomando-se como parâmetro as linhagens virais de referência. Atualmente, as seqüências gênicas estão sendo subclonadas em um vetor de expressão para células de mamíferos.
Palavras-Chave:
HIV-1. Env. Expressão heteróloga.